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作为新一代RNA原位杂交技术的代表,美国Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交检测技术,包括RNAscope,Basescope, miRNAscope已经涵盖了对所有RNA(大于300nt的长链RNA, 50-300nt的RNA片段,外显子跳跃的RNA检测,点突变的RNA检测,以及17-50nt的小RNA,例如miRNA、siRNA以及ASO)的原位检测。成为该领域的不可替代的选择(见下图)。
日前,ACD公司隆重推出了DNAscope技术,采用其RNAscope探针设计的双Z探针原理,在可见光下可以对组织原位的DNA进行检测。使得以前常规FISH检测的基因扩增(gene amplification),基因缺失(gene deletion)以及基因融合(gene break apart or fusion)可以通过该技术被敏感检测的同时,可通过可见光显微镜在明场观察到。避免了暗背景下荧光显微镜60倍油镜观察结果的限制,既可以观察到基因水平的杂交结果,也可以看清楚这个切片上的细胞和组织结构信息。为该领域的检测提供了另一种可选方案。
由于DNAscope技术可以在明场40倍光镜下观察结果,可以在观察基因扩增,缺失或者融合信号的同时,看到阳性细胞在组织中的分布,相互关系,以及整张染色切片中所有阳性信号的分布特点。同时由于DNAscope双Z探针属于工业化合成探针,避免了传统FISH通过生物学方法生成长链DNA探针中的弊端。使得探针生产工艺工业化。该技术一经推出,目前已经在基因扩增、基因缺失、基因融合、病毒载体在人类基因组整合检测等领域使用,获得了众多关注。
在基因扩增和基因缺失的检测中,通过以下示意图所述,DNAscope技术通过针对基因所在染色体着丝粒以及目标基因的检测,实现了基因扩增与缺失结果的探测。
上图为使用DNAscope在P53基因缺失检测中的应用。图中的红色信号点为TP53探针检测到的杂交信号。蓝色信号点为17号染色体着丝粒探针检测到的杂交信号。左图细胞系中只观察到蓝色信号点,提示TP53基因在该细胞系内发生了缺失。
在对基因融合的检测中,DNAscope使用到的设计原理示意图如下:
上图为使用DNA scope技术检测到的人类肺癌石蜡样本中ROS1基因融合。图中红色信号点为ROS1的5’端探针检测到的信号,蓝色为ROS1的3’端检测到的信号。左图中肺癌组织中红色和蓝色信号点重叠,提示无ROS1融合。而右侧肺癌样本中蓝色和红色信号点出现分离,可见单独的蓝色信号点。提示该样本内发生了ROS1融合。值得一提的是,左侧的阴性样本里有约5%的蓝色信号点,提示这部分细胞内存在ROS1的5’和3‘端基因分离。造成这一现象有可能是由于组织切片时这部分细胞核切割时的机械性基因分离,也有可能这类样本内确实存在少量肿瘤细胞的ROS1基因分离,但是由于以往FISH检测只能在高倍镜下对有限细胞进行观察,没有捕捉到这部分融合信息。
目前ACD公司已有一些常规基因的DNAscope探针(见下图)。对于新靶点,也可以进行探针设计。
RNAscope技术是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研发的RNA原位杂交产品,在近年来的生物检测领域发展迅速。与传统的RNA原位杂交相比,RNAscope技术属于新一代RNA原位杂交技术,其特异性的双Z探针设计避免了传统长链RNA探针的弊端,配以自身级联放大检测原理,可以高效敏感地检测到目标RNA。该方法的具体优势如下:
应用广泛
使用RNAscope技术,靶点RNA为大于等于300个碱基的特异序列,即可进行探针设计。因而RNAscope技术可以应用于几乎所有物种,所有组织以及所有基因的检测。
特异性强
RNAscope独特的双Z(ZZ) 探针设计有效的防止了探针的非特异性结合,同时降低了背景干扰。由于结合在非特异性位点的单个的Z 探针不会产生完整的信号放大分子结合位点,并会在杂交过程中被洗脱掉,从而防止非特异性信号的放大,使得探针的信号具有高度特异性。探针设计合成需要2~4周时间即可完成。
灵敏度高
RNAscope方法检测每个RNA 分子时,只需三对双Z(ZZ)探针即可完成杂交和信号的可视化。
单分子可视化和单细胞定量
使用RNAscope技术杂交上三对及以上双Z 探针即可在标准的显微镜下呈现可观察到的点状信号。ACD公司提供的分析软件更可以定量每一个单细胞内RNA 的表达水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三对双Z探针即可检测到目标RNA,而通常针对靶点RNA设计的探针为20对双Z 探针,因而即使目标RNA发生部分降解,仍可以稳定有效地检测到靶点RNA。
检测结果稳定一致性
RNAscope技术用到的探针以及所有检测试剂全部由工业化合成,且该技术针对不同样本类型(冰冻切片, 石蜡切片,悬浮细胞,贴壁细胞等)已经有成熟的实验操作流程,故使得RNAscope技术检测结果具有稳定性和一致性。除了可以在实验室进行手工操作外,该产品也可以在Leica以及罗氏Ventana自动平台上运行,为结果的一致性和稳定性提供了可靠的依据。
多通道多靶点同时检测
由于RNAscope技术可以同时进行多通道探针杂交以及信号放大,故在可见光检测中可以在同一张切片上同时检测两个靶点;而在荧光检测过程中,可以在同一张切片上检测三个或三个以上靶点RNA。